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A diferença e aplicação de quatro instrumentos de PCR comuns

2021-08-17 11:15:52
A PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma ferramenta extremamente importante na pesquisa em biologia molecular. Ele tem sido amplamente utilizado por laboratórios em todo o mundo para uma variedade de aplicações experimentais, como clonagem molecular, análise de expressão gênica, genotipagem, sequenciamento e mutação. Os quatro tipos de máquinas de PCR comumente usados ​​em laboratório são: PCR comum, PCR gradiente, PCR in situ e PCR quantitativo de fluorescência. Quais são as diferenças entre eles? O conteúdo a seguir o ajudará a responder:

PCR: Reação em Cadeia da Polimerase, que usa DNA para desenrolar (desnaturar) in vitro a 95 ° C. A 55 ° C, primers e fitas simples são combinados (anelamento) de acordo com o princípio de emparelhamento complementar de base e, em seguida, a temperatura é ajustada a cerca de 72 ° C, a DNA polimerase sintetiza fitas complementares (estende-se) ao longo da direção do ácido fosfórico para cinco açúcares de carbono (5'-3 ').

O instrumento PCR é na verdade um dispositivo de controle de temperatura, que pode realizar o controle de temperatura bem entre 95 ° C, 55 ° C e 72 ° C.

De acordo com a finalidade dos padrões de amplificação e detecção de DNA, os instrumentos de PCR podem ser divididos em: instrumentos de PCR comuns, instrumentos de PCR de gradiente, PCR in situ, instrumentos de PCR quantitativos fluorescentes em tempo real, etc.


① Máquina de PCR comum

Geralmente, uma máquina de PCR que só pode executar uma temperatura de recozimento específica para uma amplificação de PCR é chamada de máquina de PCR comum, que também é uma máquina de PCR tradicional. Se você quiser usá-lo para diferentes temperaturas de recozimento, será necessário executá-lo várias vezes.

As máquinas de PCR comuns são usadas principalmente em pesquisa científica, ensino, medicina clínica, inspeção, quarentena, etc.


② Instrumento de PCR Radient

A amplificação por PCR única pode definir uma série de diferentes condições de temperatura de recozimento (geralmente 12 gradientes de temperatura), chamado de instrumento de PCR gradiente. Fragmentos de DNA diferentes têm diferentes temperaturas de recozimento ideais. Ao definir uma série de temperaturas de recozimento de gradiente para amplificação, a amplificação por PCR única pode rastrear a temperatura de recozimento mais adequada com alto nível de expressão para amplificação eficaz.

O instrumento Gradient PCR é usado principalmente para estudar a amplificação de temperatura desconhecida de recozimento de DNA, o que economiza tempo e custos. Ele também pode ser usado como um PCR comum sem definir um gradiente. O instrumento Gradient PCR é usado principalmente em pesquisas científicas, instituições de ensino, inspeção, quarentena, etc.


③ Máquina de PCR in-situ

PCR é extrair DNA de células ou tecidos para a reação de amplificação de genes, enquanto a PCR in situ visa manter a integridade das células ou tecidos, fazer o sistema de reação de PCR penetrar em tecidos e células e executar genes na localização do DNA alvo da célula Amplificação. Não apenas o DNA-alvo pode ser detectado, mas também o tipo de célula em que o DNA-alvo existe, o que é mais propício para explorar a relação entre o DNA-alvo e a célula.

O instrumento de PCR in situ é usado principalmente para: (1) Detecção de fragmentos de genes exógenos, aumentando a taxa de detecção, com foco na inspeção de infecções virais, como HIV, HPV, HBV, CMV, etc .; (2) Observação do distribuição de patógenos no corpo Lei (3) Fragmentos de genes endógenos, como doenças monogênicas humanas, genes recombinantes, cromossomos translocados, fragmentos de mRNA de Ig, fragmentos de oncogene, etc. (4) Detecção de genes introduzidos; (5) Detecção de doenças genéticas, como β-talassemia.


④ Instrumento de PCR quantitativo fluorescente em tempo real

O sistema de aquisição de sinal fluorescente e o sistema de análise e processamento de computador são adicionados com base no design do instrumento PCR comum para formar um instrumento PCR com função quantitativa de fluorescência. O princípio da amplificação por PCR é o mesmo da amplificação por PCR comum. Os primers adicionados durante a amplificação por PCR são marcados com isótopos, fluoresceína, etc., e os primers e sondas fluorescentes são usados para se ligar especificamente ao modelo ao mesmo tempo para amplificação. O resultado amplificado é conectado ao sistema de análise e processamento do computador por meio do sinal de aquisição em tempo real do sistema de aquisição do sinal de fluorescência, e a saída do resultado quantificado em tempo real é obtida.

As máquinas de PCR quantitativo de fluorescência são divididas em canal único, canal duplo e multicanal. Quando apenas uma sonda fluorescente é usada para rotulagem, use um único canal; quando houver vários rótulos fluorescentes, use vários canais. Um único canal também pode detectar marcadores de multifluorescência e produtos de expressão de genes alvo, porque apenas uma quantidade de amplificação de gene alvo pode ser detectada por vez, e múltiplas amplificações são necessárias para detectar a quantidade de fragmentos de genes alvo diferentes. Os multicanais conduzem ao PCR multiplex e realizam a função de detectar vários genes-alvo ao mesmo tempo.

O instrumento de PCR quantitativo de fluorescência é usado principalmente em testes médicos clínicos, pesquisa e desenvolvimento de biomedicina, indústria de alimentos, instituições de pesquisa científica, etc. A tecnologia de detecção quantitativa de fluorescência tem muitos aspectos de diagnóstico clínico, principalmente com foco no diagnóstico clínico de doenças causadas por vários patógenos, como hepatites, doenças venéreas, doenças relacionadas ao pré e pós-natal e tuberculose. 

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